Terminato nel: 2019
Il progetto è dedicato alla memoria di “Bruno Ravelli” ed è finanziato in parte da una donazione di amici e parenti.
Andrea Lunardi, PhD Associate Professor in Molecular Biology Computational Oncology Laboratory Centre for Integrative Biology (CIBIO) University of Trento
l progetto è dedicato alla memoria di “Bruno Ravelli” ed è finanziato in parte da una donazione di amici e parenti.
Introduzione:
La World Health Organization (WHO) ha stimato nel 2021 approssimativamente 400.000 decessi per tumore alla prostata nei paesi industrializzati mentre il National Cancer Institute ha valutato in poco meno di 12 Bilioni di dollari la spesa degli Stati Uniti associata alle cure dei pazienti affetti da tumore prostatico nel solo 2018. Attualmente circa il 90% dei tumori prostatici si presentano confinati all’interno della ghiandola alla diagnosi ed hanno in genere prognosi favorevole sia che vengano trattati radiologicamente che chirurgicamente. Circa un 30% di questi tumori è destinato a progredire allo stadio metastatico tra i 5 e gli 8 anni dalla terapia. Peggiore è la situazione per i pazienti affetti da tumore ad alto rischio o localmente avanzato, la maggior parte dei quali, purtroppo, svilupperà metastasi.
Infine, una porzione piccola, ma non per questo meno importante, di pazienti presenta lo stadio metastatico della malattia alla diagnosi. Per gli stadi avanzati della malattia il trattamento d’elezione, nonch praticamente l’unico, resta quello ormonale. Nonostante la terapia sia inizialmente efficace nella quasi totalità dei pazienti, il tumore acquista resistenza in media dopo 18-24. Si definisce così l’inizio dello stadio della malattia definito ‘castrazione resistente’ per il quale i trattamenti chemioterapici soprattutto a base di taxani sono la linea terapeutica d’elezione. Purtroppo però solo un 30% dei pazienti riesce a varcare la soglia dei 5 anni dall’inizio della terapia (Mottet N. et al., 2018; Teo M.Y. et al., 2019; Swami U. et al., 2020). E’ chiaro che il tumore alla prostata necessità di maggiore attenzione da parte della ricerca pre-clinica e clinica con il chiaro obiettivo di delineare nuove strategie terapeutiche, da un lato sfruttando in modo appropriato farmaci già presenti in clinica (Caffo O., et al., 2016), mentre dall’altro definendone maggiormente il livello di efficacia (Smith M.R. et al., 2022; Hussain M. Et al., 2022).
A conferma dell’importanza che il connubio tra ricerca pre-clinica e clinica riveste in campo oncologico, e’ di pochi giorni fa l’approvazione da parte della Food and Drug Administration americana di un nuovo radio-farmaco (Lu-PSMA 617) per il trattamento dello stadio metastatico resistente alla castrazione (Gafita A. Et al., 2021). L’azione genotossica dell’atomo radioattivo di Lutezio viene veicolata alle cellule tumorali prostatiche grazie alla presenza di una molecola (PSMA 617) in grado di riconoscere la proteina di membrana PSMA abbondantemente espressa dalle cellule tumorali. Una criticità che rimane fortemente legata all’uso di agenti chemio/radio terapici è la loro ridotta efficacia su cellule tumorali in stato quiescente. Tali cellule, spesso identificate come cellule staminali del tumore (Cancer Stem Cells), sono in grado di elaborare meccanismi di resistenza alla terapia generando masse tumorali sempre meno controllabili clinicamente (Aramini B. et al., 2022).
Negli ultimi anni due importanti cambiamenti in oncologia hanno contribuito a migliorare considerevolmente la prognosi di pazienti affetti da specifiche forme tumorali: la Medicina di Precisione e le Terapie Immunologiche. La Medicina di Precisione si fonda sul concetto che ciascun tipo di tumore può essere classificato in molteplici sottotipi in base a specifiche alterazioni molecolari che lo caratterizzano. Ne consegue che sottotipi distinti risponderanno in modo diverso al medesimo approccio terapeutico e, viceversa, che l’identificazione di precise strategie terapeutiche a bersaglio accuratamente definite per ciascuno dei diversi sottotipi è essenziale per migliorare la prognosi dei pazienti (Lunardi A. et. al., 2014; Re A., et al., 2018).
Tra i casi più evidenti dell’efficacia delle combinazione di terapie a bersaglio e stratificazione molecolare del tumore sono: il trattamento con Gleevec per la Leucemia Mieloide Cronica dipendente dall’oncoproteina BCR-ABL (Wong S. et al., 2004), la combinazione di acido retinoico all-trans e triossido di arsenico per il trattamento della Leucemia Promielocitica Acuta dipendente dall’oncoproteina PML-RARa (Nardella C. et al., 2011), l’uso degli inibitori (Erlotinib, Gefitinib, Lapatinib) del recettore per il fattore di crescita epiteliale (EGFR) nel tumore del polmone non-a-piccole-cellule caratterizzato da mutazioni del recettore stesso, l’inibizione mediante anticorpi monoclonali del recettore tirosin-chinasico HER2 nel tumore al seno caratterizzato da amplificazione dello stesso (Friedlaender A. et al., 2022).
Nel 2018 il premio Nobel per la Medicina è stato assegnato all’americano James P. Allison ed al giapponese Tasuku Honjo per aver identificato specifici approcci immunologici in grado di riattivare l’azione anti-tumorale del sistema immunitario tenuta ‘sedata’ dal tumore stesso mediante precisi meccanismi molecolari. Le strategie immunologiche in questione sono ormai solidamente entrate nella pratica clinica per il trattamento di alcune tipologie tumorali prima fra tutte il melanoma (Carlino M.S. et al., 2021).
In conseguenza di una elevatissima frequenza di mutazioni genetiche le cellule del melanoma espongono sulla loro membrana un numero elevatissimo di antigeni ‘tumore-specifici’ (neo-epitopi) e diverrebbero facile preda del sistema immunitario se non fosse per la loro potente azione sedativa. La somministrazione di anticorpi monoclonali in grado di bloccare tali meccanismi riattiva il sistema immunitario innescando così una forte risposta anti-tumorale. Sebbene l’efficacia degli approcci immunologici sia considerata particolarmente adatta per i tumori definiti ‘caldi’ ovvero altamente riconoscibili dal sistema immunitario grazie alla cospicua presenza in membrana di neo-epitopi (Figura 1), specifiche sottoclassi di tumori considerati genericamente ‘freddi’ potrebbero comunque rispondere positivamente a stimoli immunitari come evidenziato da alcuni trial clinici con gli inibitori del check-point immunitario in pazienti con tumore al polmone, fegato, mammella, vescica e prostata (Robert C. 2020; Sharma P. et al., 2021).
Razionale Nel 2014 il gruppo di Hans Clevers (vincitore del premio Pezcoller 2021) ha definito la metodica per generare organoidi da tessuto prostatico sia murino che umano (Karthaus W.R. et al., 2014). Gli organoidi sono un’incredibile risorsa per la ricerca oncologica consentendo finalmente lo studio in vitro di sofisticati avatars di tessuto adulto del quale mantengono architettura e fisiologia. L’utilizzo di organoidi di tessuto prostatico sano murino ci ha permesso per esempio di identificare i meccanismi che governano l’omeostasi del tessuto prostatico adulto, definendo i segnali molecolari che ne regolano il rapporto tra proliferazione e quiescenza delle cellule progenitrici, il loro differenziamento nella linea luminale, ma anche di scoprire il ruolo di eventi genetici molto precoci nel processo tumorigenico prostatico (Cambuli F. et al., 2022; Lorenzoni M. et al., 2022).
Recentemente grazie alla collaborazione con l’Università di Torino e ad un finanziamento del Ministero della Ricerca, abbiamo deciso di provare a generare organoidi di tessuto prostatico sano e tumorale prelevato mediante prostatectomia radicale da pazienti affetti da tumore prostatico di alto grado (Gleason 8/9). Nonostante sia noto che il protocollo per la generazione di organoidi prostatici umani è alquanto inefficiente, grazie probabilmente alla profonda esperienza acquisita in questi anni con gli organoidi di prostata murina, abbiamo generato organoidi prostatici sia da tessuto sano che dalla controparte tumorale del medesimo paziente (Figura 2).
Grazie ad accurate analisi molecolari eseguite con gli organoidi prostatici murini sappiamo che gli organoidi derivati da tessuto prostatico sano hanno caratteristiche tipiche di cellule progenitrici/staminali tipiche dell’organo adulto (Cambuli F. et al., 2022), il che giustifica sia la loro capacità rigenerativa indefinita, l’indipendenza dagli androgeni per sopravvivenza e proliferazione, e la capacità di generare cellule luminali correttamente organizzate nella tipica architettura epiteliale ghiandolare in presenza di testosterone (Cambuli F. et al., 2022; Lorenzoni M. et al., 2022).
Traslando tali principi agli organoidi umani se ne ottiene un modello di studio eccellente per la definizione da un lato dei processi implicati nell’omeostasi e rigenerazione del tessuto adulto sano, dall’altro dei circuiti molecolari che governano le cellule staminali tumorali. Tali nozioni potrebbero aprire la strada verso approcci di terapia a bersaglio sia di tipo farmacologico che immunologico con importanti ricadute nella pratica oncologica (Alaimo A. et al., 2020; Lunardi A. et al., 2021; Genovesi S. et al., 2022). Obiettivi Il progetto si propone tre obiettivi principali: Obiettivo 1 (1-12 mo): Ampliare la casistica di organoidi prostatici umani derivati da tessuto sano e tumorale. Obiettivo 2 (2-8 mo): Definire le alterazioni genomiche caratterizzanti gli organoidi tumorali. Obiettivo 3 (4-12 mo): Identificare possibili bersagli molecolari la cui modulazione farmacologica possa favorire l’efficacia terapeutica di approcci oncologici convenzionali.
Attività di Ricerca
Obiettivo 1.
Ci aspettiamo di ricevere dai collaboratori di Torino 24 campioni prostatici nell’arco dei prossimi 12 mesi. Una volta giunto al CIBIO nell’arco delle 12/18 ore dalla chirurgia, il tessuto prostatico umano verrà immerso in 1/1,5 mL di una soluzione di Dispasi II/Collagenasi II e dissociato sia enzimaticamente che meccanicamente mediante apposite pinzette da microdissezione. Il tessuto frammentato sarà poi trasferito in un apposito contenitore (Miltenyi Biotec, 130-093-237) e disgregato a livello di singole cellule utilizzando il programma A.01-C del dissociatore gentleMACS (Miltenyi Biotec, 130-093-235). La soluzione verrà quindi centrifugata a 300 g per 5 minuti, il sopranatante eliminato ed il pellet risospeso in 1 mL di una soluzione di TrypLE + 1 μg/mL DNAse I + 10 μM Y-27632, trasferito in un tubo Eppendorf da 1,5 mL e incubato per 15 minuti a 37°C. Dopodichè, le cellule saranno centrifugate a 300 g per 5 minuti, lavate due volte con PBS-BSA 0,1%, filtrate con appositi filtri e contate con la camera di Bürker. Approssimativamente 20.000 cellule verranno rispospese in 50 μl of AdDMEM4 + 10 μM Y-27632 in un tubo Eppendorf al quale si aggiungeranno 200 μl di Matrigel® (Corning, 356231) or BME-2 (AMSBIO, 3533). La soluzione sarà suddivisa in aliquote da 40 μl che verranno depositate sul fondo di una piastra da colture cellulari, fatte solidificare in un incubatore (5% CO2, 37°C) per 20 minuti e quindi coperte con apposito terreno condizionato da un cocktail di specifici fattori di crescita. La crescita degli organoidi sarà seguita giornalmente mediante microscopia. In base alla nostra esperienza, le cellule prostatiche cresceranno inizialmente molto lentamente come aggregati cellulari. Verranno perciò recuperate dalle gocce di Matrigel® e seminate nuovamente in Matrigel® fresco con medium e fattori per alcune settimane (6-8) fino a che i primi organoidi non saranno chiaramente visibili. Questi, una volta raccolti, disgregati e le cellule nuovamente piastrate daranno origine alle nuove linee che si andranno ad aggiungere a quella già esistente permettendo così di ampliare la casistica e consolidare statisticamente i dati.
Obiettivo 2.
Le linee di organoidi normali e tumorali saranno utilizzate per analisi di tipo genomico allo scopo di identificare le alterazioni molecolari che caratterizzano la linea tumorale.
L’estrazione del DNA genomico verrà effettuata con il kit della Sigma GenElute™ Mammalian Genomic DNA Miniprep seguendo il protocollo fornito. Una volta quantificato e definita la purezza mediante analisi spettrofotometriche i vari campioni verranno consegnati alla facility di Next Generation Sequencing del CIBIO per la preparazione delle apposite librerie e successivo sequenziamento.
I risultati verranno accuratamente interpretati mediante apposite pipeline di analisi computazionale disponibili in CIBIO. Infine, le signatures genomiche identificate verranno confrontate con quelle descritte in letteratura in modo da associare le linee di organoidi generate a specifiche classi tumorali. Obiettivo 3. Sfruttando la facility di HighTroughput operante al CIBIO ed in particolare il sistema robotizzato di trattamento e analisi Operetta, gli organoidi sani e tumorali verranno sottoposti ad uno screening farmacologico sfruttando specifiche librerie di farmaci e molecole presenti in facility.
Gli organoidi sia sani che tumorali verranno cresciuti in piastre da 96 pozzetti, sottoposti tutti ad approcci standard di terapia ormonale (deprivazione androgenica combinata con enzalutamide, abiraterone, darolutamide e apalutamide) e chemioterapica (docetaxel, cabazitaxel), ed infine trattati in modo automatizzato con singole molecole/farmaci presenti nella libreria. La risposta degli organoidi ai trattamenti verrà valutata tramite analisi della vitalità cellulare con appositi coloranti fluorescenti e quantificato dal sistema di imaging computerizzato del sistema Operetta. Rilevanza Quello prostatico è considerato un tumore piuttosto eterogeneo per quanto riguarda le alterazioni molecolari che lo caratterizzano. Sebbene alcune di queste ricorrano con una certa frequenza e siano sfruttate dal punto di vista terapeutico (terapia ormonale), identificare una terapia che possa essere efficace nel lungo periodo per tutte le diverse classi molecolari del tumore è pressochè impossibile.
Il concetto di Oncologia Personalizzata si basa invece sull’ottimizzazione dei trattamenti clinici in funzione delle caratteristiche molecolari del tumore. In questo scenario, la generazione di organoidi derivati da tumori primari in stadio avanzato (Gleason >8) permetterà di identificare specifiche vulnerabilità di popolazioni di cellule staminali tumorali, notoriamente resistenti alle terapie convenzionali, distinte sulla base delle alterazioni molecolari che ne sostengono la tumorigenicità
